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什么是微分干涉差顯微鏡?DIC是什么原理?

發布時間:2019/12/19

什么是微分干涉差顯微鏡?DIC是什么原理?

1952年,Nomarski在相差顯微鏡原理的基礎上發明了微分干涉差顯微鏡。DIC顯微鏡又稱Nomarski相差顯微鏡(Nomarki contrast microscope),其優點是能顯示結構的三維立體投影影像。與相差顯微鏡相比,其標本可略厚一點,折射率差別更大,故影像的立體感更強。

微分干涉相襯顯微鏡(DIC顯微鏡 differential interference contrast microscope)的物理原理完全不同于相差顯微鏡,技術設計要復雜得多。DIC利用的是偏振光,透射式DIC顯微鏡有四個特殊的光學組件:偏振器(polarizer)、DIC棱鏡、DIC滑行器和檢偏器(analyzer)。偏振器直接裝在聚光系統的前面,使光線發生線性偏振。在聚光器中則安裝了石英Nomarski棱鏡,即DIC棱鏡,此棱鏡可將一束光分解成偏振方向不同的兩束光(x和y),二者成一小夾角。聚光器將兩束光調整成與顯微鏡光軸平行的方向。最初兩束光相位一致,在穿過標本相鄰的區域后,由于標本的厚度和折射率不同,引起了兩束光發生了光程差。在物鏡的后焦面處安裝了第二個Nomarski棱鏡,即DIC滑行器,它把兩束光波合并成一束。這時兩束光的偏振面(x和y)仍然存在。最后光束穿過第二個偏振裝置,即檢偏器。在光束形成目鏡DIC影像之前,檢偏器與偏光器的方向成直角。檢偏器將兩束垂直的光波組合成具有相同偏振面的兩束光,從而使二者發生干涉。x和y波的光程差決定著透光的多少。光程差值為0時,沒有光穿過檢偏器;光程差值等于波長一半時,穿過的光達到最大值。于是在灰色的背景上,標本結構呈現出亮暗差。為了使影像的反差達到最佳狀態,可通過調節DIC滑行器的縱行微調來改變光程差,光程差可改變影像的亮度。調節DIC滑行器可使標本的細微結構呈現出正或負的投影形象,通常是一側亮,而另一側暗,這便造成了標本的人為三維立體感,類似大理石上的浮雕,如下圖。
DIC顯微鏡下的硅藻(偽彩色)
DIC顯微鏡使細胞的結構,特別是一些較大的細胞器,如核、線粒體等,立體感特別強,適合于顯微操作。目前像基因注入、核移植、轉基因等的顯微操作常在這種顯微鏡下進行。
落射式的DIC顯微鏡則只需要三個特殊的光學組件:偏振器(polarizer)、DIC棱鏡和檢偏器(analyzer),其光學原理如圖所示:

由圖可知:由光源發出的光波經起偏器后經半透半反鏡入射至Nomarski偏振棱鏡,棱鏡將其分成兩束具有微小夾角、振動方向相互垂直且振幅相等的線偏振光,通過筒長無限顯微物鏡后,產生剪切量為△x(略小于顯微鏡分辨率)的平行光入射到放置在載物臺上的被測表面,從被測表面反射的兩束正交偏振光各自經原路返回,由棱鏡重新復合共線,經檢偏器后成像在像面上。由于被剪切的光束產生的分離量略小于顯微鏡的分辯極限,因而在視場中看不到干涉條紋,通過將被測樣品的位相變化轉化為光強的變化,可看到具有立體感的浮雕成像。
DIC顯微鏡廣泛應用于生物醫學、材料科學等領域。
微分干涉相襯觀察法 (DIC) 顯微鏡檢查是明場顯微鏡檢查的明智之選,利用這種先進的技術手段可以觀察到未染色的試樣,而這些試樣在明場中成像較弱。
利用偏振光觀察浮雕樣成像
未染色試樣通常并不顯眼,在明場顯微鏡檢查中幾乎看不到試樣的細節。但實際上,這些試樣會與穿過它們的光源發生作用,并產生相移,而這些現象肉眼是看不見的。染色會導致振幅偏移,且穿過的光線強度會存在差異,但絕大多數情況下,無生命的試樣才會發生上述現象。DIC 顯微鏡檢查是一種利用光程長度的梯度差和相移,令相位物體在光學顯微鏡下清晰可見的技術手段。用戶可以利用這種方式,通過適當的相襯度和分辨率來觀察活細胞和有機體。
DIC 顯微鏡產生的圖像為浮雕狀,看起來有投影。這些圖像沒有光暈現象,相對其他顯微鏡而言,由于具備光學切片功能,即使較厚的試樣也依然能夠成像。
在 DIC 顯微鏡檢查中,只有偏振光可用于試樣照明。上述偏振光通過偏光正交平面,被色散成兩條不同的光射線。這兩條光射線彼此非常接近。由于這兩條光射線在試樣中會發生折射或散射,因此,會產生不同的相移。如果這些光射線重新聚合,它們會互相干涉。光線此時為橢圓偏光。該偏光將通過檢偏鏡轉變成振幅移位。通過這種方式,令高達 1/200 波長(使用照相機時,甚至達 1/1000 波長)之間波長差的相位移動,以及整個波長都清晰可見。


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